关键词：
纳米银
水生生物
斑马鱼
生长发育
细胞凋亡
神经毒性
摘要：
随着纳米科技的迅速发展,纳米材料的潜在生态环境效应引起越来越多的关注。纳米银由于独特的理化特性及优越的抗菌性能而成为生物医疗及消费品等领域中使用最多的纳米材料之一。这些产品的使用会使纳米银释放进入生活污水或工业废水,随地表径流最终进入河流湖泊或海洋等水体环境,然而其对水生生物的潜在影响目前还处于探索阶段。本文选用斑马鱼为模式生物进行实验,从三个部分探究了纳米银对斑马鱼胚胎早期阶段的毒性影响及其可能的机制,为探索纳米银对水生生物的影响提供科学依据。本文首先研究了纳米银对斑马鱼胚胎的致畸效应和粒径效应。将受精后4小时(4 hpf)的斑马鱼胚胎分别暴露于不同浓度的4 nm和10 nm纳米银的溶液中至96 hpf,通过暴露试验结果计算得到4 nm和10 nm纳米银对斑马鱼胚胎96h的半数致死浓度(LC50)分别为6.69 mg/L和11.75 mg/L,半数有效浓度(EC50)分别为4.12 mg/L和5.91 mg/L。斑马鱼胚胎的畸形率随纳米银暴露浓度的增加而增高,且暴露的斑马鱼胚胎出现体长变短,卵黄囊吸收不完全,头部变小,眼睛变小,心脏畸形以及体节消失等畸形。其中,头部变小,卵黄囊吸收不完全和体节消失出现的比例相对较高。此外,纳米银的毒性呈现粒径效应,粒径较小的纳米银(4 nm)毒性高于粒径较大的纳米银(10 nm)毒性。接着探索了纳米银如何通过诱导凋亡影响斑马鱼胚胎早期生长发育。根据体长变短和卵黄囊吸收不完全畸形,本文深入研究了纳米银对斑马鱼胚胎生长发育的影响,同时与银离子的作用机制进行比较。经测定发现实验所用的纳米银溶液中没有银离子释放,银离子对斑马鱼胚胎96 h的LC50为0.054 mg/L,表明银离子毒性远大于纳米银。纳米银和银离子均能延迟斑马鱼胚胎的孵化并且降低孵化率,使孵化出的斑马鱼体长明显变短,总蛋白含量也相应减少,表明二者均能阻碍生长发育。吖啶橙(AO)染色实验表明纳米银和银离子分别使暴露的斑马鱼胚胎躯干和卵黄囊部位出现细胞凋亡信号,检测活性氧(ROS)水平发现暴露的斑马鱼胚胎内ROS量显著高于空白对照组。进一步通过RT-PCR分析,结果表明纳米银主要是可通过caspase的内源性通路造成细胞凋亡,而银离子不但能影响斑马鱼的氧化系统相关基因,而且能激活p53基因进而造成细胞凋亡,从而影响斑马鱼胚胎的生长发育。在纳米银对斑马鱼胚胎的神经毒性部分,着重研究了头部和眼睛发育不全这些常见于神经毒性的表型。畸形表型观察发现纳米银暴露能使斑马鱼胚胎头部界限模糊,后脑发育不全,眼部色素减少。分子水平研究发现,纳米银暴露改变了斑马鱼胚胎内gfap, huC和ngnl这些神经相关基因和解毒重金属的金属硫蛋白基因MT和ABCC基因的表达,且斑马鱼胚胎头部ABCC2基因的上调表达较躯干内的更显著。这些结果表明纳米银可能影响了斑马鱼神经细胞的分化进而产生了神经毒性。暴露的斑马鱼胚胎在72 hpf时心率明显减弱,而心脏发育相关的基因Nkx2.5和Gata5表达水平却没有明显变化。此外,纳米银还改变了斑马鱼体内AhR2和Cyp1A这类介导多环芳烃毒性的基因。同时斑马鱼胚胎内纳米银的累积结果表明4 nm银的累积高于10 nm银,这与纳米银毒性的粒径效应相吻合；而且斑马鱼头部银的含量接近或略高于躯干,这可以进一步解释ABCC2基因表达的结果和纳米银表现出的神经毒性。本文研究表明,纳米银能够对水生生物产生明显的致畸效应,甚至较高浓度时能够影响其存活,并且粒径较小的纳米银毒性相对较强。纳米银对水生生物的毒性机制主要表现为能诱导细胞凋亡和氧化损伤,进而阻碍生物早期的生长发育。此外,纳米银表现出较强的神经毒性,能影响神经细胞的分化。然而,本研究中纳米银溶液中没有银离子的释放,表明纳米银的毒性不能仅仅归因于银离子,且银离子的毒性远高于纳米银。本研究通过急性暴露实验初步表明纳米银能够影响水生生物的孵化和繁殖,孵化出的生物也有体长变短等生长发育明显受抑制的现象,甚至会出现头部和眼睛发育不全等神经缺陷。据此不排除环境中的纳米银可能在低浓度长期暴露下对水生生物产生类似的慢性危害。
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